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技術(shù)文章

TECHNICAL ARTICLES

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連發(fā)3篇hiPSC文章,單細胞可視化培養系統,分離效率高達100%!

更新時(shí)間:2024-06-14點(diǎn)擊次數:36

人類(lèi)誘導多能干細胞 (hiPSC) 是通過(guò)基因編輯技術(shù)(如 CRISPR-Cas9)對已經(jīng)高度分化的人體細胞進(jìn)行重新逆分化得到的多能干細胞。傳統的hiPSC細胞系構建與培養過(guò)程操作復雜、耗材昂貴且費時(shí)費力。特別是對于異質(zhì)編輯細胞池中構建的克隆hiPSC系的培養,受到了傳統細胞培養方法的桎梏,很難構建一個(gè)高效的hiPSC構建與培養工作流程。此外,現有的單細胞分離和培養方法通常對細胞的處理條件要求苛刻,操作步驟繁瑣,無(wú)法充分保證單克隆性。


為應對hiPSC細胞系構建與培養過(guò)程中的諸多挑戰,iotaSicences公司采用了以GRID技術(shù)為核心的高度自動(dòng)化的單細胞可視化培養系統isoCell,構建了用于 hiPSC細胞系培養的平臺。該平臺采用全自動(dòng)化流程,操作條件溫和,對單細胞無(wú)損傷,具有高通量、自動(dòng)化、高成活率等優(yōu)勢,可確保分選出的細胞100%為單細胞。柏林醫學(xué)大學(xué)多能干細胞和類(lèi)器官研究中心的Harald Stachelscheid團隊使用isoCell在Stem Cell Research期刊上發(fā)表了三篇構建不同功能的hiPSC細胞系的科研應用文章,展示了isoCell在hiPSC細胞系構建和培養方面的優(yōu)勢。


圖1 單細胞可視化培養系統isoCell實(shí)物圖

 

1. 以isoCell為核心的hiPSC細胞培養平臺


isoCell系統組成的細胞培養平臺是基于GRID技術(shù)的高度自動(dòng)化的實(shí)驗平臺。GRID是指在細胞培養基上采用FC40液體分隔出的網(wǎng)格小室,體積?。ê牟纳伲?,光學(xué)透明度高,可以容納細胞在內生長(cháng),且各個(gè)小室之間物質(zhì)不流通。isoCell系統配備了熒光和成像系統,用于在整個(gè)克隆工作流程中記錄 GRID 小室的圖像(見(jiàn)下圖)。



圖2 GRID實(shí)物圖

 

isoCell 可自動(dòng)執行所有液體處理步驟,包括構建 GRID、將單細胞注射到GRID小室中以及交換培養基和收獲單克隆集落,在整個(gè)工作流程中自動(dòng)檢測每一個(gè) GRID 小室,并確保每一個(gè)單克隆hiPSC細胞系來(lái)源于單個(gè)細胞。



圖3  isoCell操作流程圖

 

2. 生成具有 SLC16A2:G401R 或 SLC16A2 敲除的 iPSC系


X染色體相關(guān)的AHDS綜合征的發(fā)病特點(diǎn)是由編碼甲狀腺激素轉運蛋白MCT8(單羧酸轉運蛋白8)的SLC16A2基因突變引起精神運動(dòng)發(fā)育嚴重受損。


該團隊使用CRISPR/Cas9技術(shù)(靶向 SLC16A2 的外顯子3)將AHDS患者錯義變體G401R和新型敲除缺失變體 (F400Sfs*17) 引入男性健康供體的hiPSC系(BIHi001-B)。通過(guò)isoCell培育成功地獲得了SLC16A2基因敲除的hiPSC單克隆細胞系(BIHi001-B-7)和(BIHi001-B-8),并證明了這些新細胞系在模擬 MCT8 缺陷對人類(lèi)神經(jīng)發(fā)育的影響方面的實(shí)用性。文章以Generation of iPSC lines with SLC16A2:G401R or SLC16A2 knock out為題發(fā)表于Stem Cell Research期刊上。



圖4  WB驗證SLC16A2 敲除的hiPSC系無(wú)法表達SLC16A2蛋白

 

3. 生成 THRB-GS(E125G_G126S) 和 THRB-KO 人類(lèi) iPSC 系以研究非典型甲狀腺激素信號傳導


THRB是一種依賴(lài)甲狀腺激素 (TH) 結合來(lái)調節基因表達的核受體。相同的受體也可以介導細胞質(zhì)中信號通路的激活。目前尚無(wú)法區分這兩種機制中的哪一種是造成 TH 生理效應的原因。


該團隊結合基因編輯與isoCell的單細胞培養基技術(shù),成功建立了一種在 THRB DNA 結合域中具有兩個(gè)突變 (E125G_G126S) 的hiPSC 細胞系(BIHi001-B-2/3),該突變消除了THRB的核受體作用,因此可以用該細胞系專(zhuān)門(mén)研究THRB的信號通路激活作用。該團隊還生成了 THRB 敲除細胞系(BIHi001-B-6)以消除所有 THRB 效應。通過(guò)比較WT結果和這兩種細胞系,將甲狀腺激素的影響歸因于潛在的機制。文章以Generation of THRB-GS(E125G_G126S) and THRB-KO human iPSC lines to study noncanonical thyroid hormone signalling為題發(fā)表于2024年2月的Stem Cell Research期刊上。



圖5  基因測序驗證BIHi001-B-2/3和BIHi001-B-6細胞系敲除或突變了對應基因

 

4. 使用 CRISPR-Cas9 生成了兩個(gè) BAX/BAK 雙敲除人類(lèi)誘導多能干細胞系 (iPSC)


腦缺血損傷很多是由于腦缺血狀態(tài)下細胞凋亡導致的。Bcl-2基因相關(guān)的X 蛋白 (BAX) 和BCL2 拮抗因子/殺手1(BAK)是 BCL2 家族的兩個(gè)促凋亡因子,BAX 和BAK是線(xiàn)粒體凋亡的執行基因,與細胞凋亡密切相關(guān)。


該團隊使用 CRISPR-Cas9技術(shù)構建了兩個(gè) BAX/BAK 雙敲除人類(lèi)誘導多能干細胞BIHi005-A-17和BIHi250-A-1,并通過(guò)isoCell培養獲得了對應的hiPSC單克隆細胞系。所得細胞系核型正常,具有典型的形態(tài)并表達未分化狀態(tài)的典型標記,并通過(guò)基因技術(shù)驗證了細胞系已敲除BAK基因。在后續的研究中,研究人員就可以將該BAX/BAK 雙敲除的hiPSC細胞系廣泛應用于腦缺血等細胞凋亡相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)病機制與治療干預機制研究中。文章以Generation of two human induced pluripotent stem cell lines with BAX and BAK1 double knock-out using CRISPR/Cas9為題發(fā)表于2024年4月的Stem Cell Research期刊上。



圖6 通過(guò)基因測序及WB驗證BIHi005-A-17和BIHi250-A-1以敲除BAK與BAX基因

 

5. 結論


以isoCell構建的hiPSC細胞培養平臺可以對hiPSC細胞進(jìn)行全自動(dòng)化且溫和地單細胞培養。通過(guò)isoCell有的GRID小室網(wǎng)格技術(shù)與可視化分選相結合,可以確保每一個(gè)單克隆hiPSC細胞系均來(lái)自單個(gè)細胞,且節省培養耗材。


isoCell的培養條件溫和,在以上案例中協(xié)助科研人員構建了多個(gè)基因改造hiPSC單克隆細胞系,成活率高。

 

單細胞可視化培養系統isoCell的優(yōu)勢:

? 全自動(dòng)化流程

? 操作條件溫和,對單細胞無(wú)損傷

? 全培養、分析流程可追蹤

? 單細胞率高達100%

? 單克隆細胞系構建成活率高

? 結構緊湊,體積小,節省耗材



單細胞可視化分選培養系統-isoCell已在Cell、Advanced Science、Small Methods、Nature Communications等期刊發(fā)表多篇文章,如下摘引了近年三篇具有代表性的文獻和大家分享。


  • Soitu C, Stovall‐Kurtz N, Deroy C, et al. Jet‐Printing Microfluidic Devices on Demand[J]. Advanced Science, 2020, 7(23): 2001854.

  • Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.

  • Deroy C, Nebuloni F, Cook P R, et al. Microfluidics on Standard Petri Dishes for Bioscientists[J]. Small Methods, 2021, 5(11): 2100724.

  • Deroy C, Wheeler J H R, Rumianek A N, et al. Reconfigurable microfluidic circuits for isolating and retrieving cells of interest[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(22): 25209-25219.

  • Oliveira N M, Wheeler J H R, Deroy C, et al. Suicidal chemotaxis in bacteria[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7608.


樣機體驗:



為更好地服務(wù)中國科研工作者,Quantum Design 中國也建立了樣機演示實(shí)驗室,將為大家提供為專(zhuān)業(yè)的售前、銷(xiāo)售、售后技術(shù)支持,歡迎各位老師通過(guò)電話(huà)010-85120280、發(fā)送郵件info@qd-china.com、點(diǎn)擊此處掃描下方二維碼參觀(guān)試用!



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用戶(hù)評價(jià)


路易莎·埃姆斯,研究科學(xué)家:

The Native Antigen Company(LGC 臨床診斷集團旗下公司)


“使用 isoCell 進(jìn)行單細胞克隆工作從一開(kāi)始就簡(jiǎn)單可靠,并且已無(wú)縫地融入我們的流程中。 該程序對細胞很溫和,我們看到非常好的存活率,可以篩選大量克隆。 我們收到的客戶(hù)服務(wù)是優(yōu)質(zhì)的。"


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